人工核酸内切酶技术CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)/Cas9是当前最有效的基因编辑工具.外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是细菌主动分泌和吸收的双层膜结构,具有运载DNA、蛋白等多种物质的能力.为探究以OMVs为CRISPR编辑工具的转运载体、用于病原菌清除的可行性,本研究以高致病性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus,GBS)为材料,在原有CRISRR质粒pCas9的基础上,通过分子克隆,构建穿梭质粒pCas9-2.0和具有靶向剪切无乳链球菌cfb基因的毒性质粒pCas9-cfb,将质粒pCas9-cfb转入asd缺陷型大肠杆菌X6097后,一方面进行重组菌的OMVs制备、电镜观察和DNA分析,另一方面与GBS混合培养,最后在选择平板上对GBS菌落计数.结果显示,重组了质粒pCas9-cfb的X6097能够分泌OMVs且内含质粒;实验组平板上没有GBS菌落产生;对照组平板上菌落经鉴定皆为含pCas9-2.0的GBS,且菌落数量随共培养时间的延长和卡那霉素(Kan)的浓度升高而增多.综上可见,OMVs可以运载CRISPR为染色体剪切工具、并实现对靶向病原菌的定向清除,但受OMVs分泌量的限制消除效率较低.同传统的预防性疫苗相比,本研究为病原菌清除提供了一个新的研究方向;同当前以噬菌体为载体的研究思路相比,本方法更简便、成本更低.另外,本研究也为难以进行电击转化的菌株提供了一个更简单的质粒转化方法.
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