桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

摘要

【目的】建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持。【方法】以丰驰桑为试验材料,克隆含BamHI和XbaI酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经XbaI和BamHI双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片。【结果】克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS。桑树叶片被侵染15d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型。实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制。【结论】利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定。