新型受体相互作用蛋白激酶3突变体的激酶活性研究

摘要

目的·研究新型受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)突变体的激酶活性。方法·分别对RIPK3中的4个氨基酸(Q84WDF87)进行突变,并将这些突变体与混合谱系蛋白激酶样假激酶(mixed lineage kinase domain likepseudokinase,MLKL)共同转染到HEK293T细胞中。通过Western blotting检测新型RIPK3突变体S232位点自磷酸化的情况及其对MLKL S345位点磷酸化的影响;通过免疫共沉淀法观察RIPK3与MLKL之间的相互作用;采用非还原裂解法检测MLKL的寡聚化情况。结果·RIPK3ΔQ84、RIPK3ΔW85和RIPK3ΔD86的激酶活性显著降低,RIPK3Q84A/RIPK3Q84E、RIPK3W85Y和RIPK3D86A/RIPK3D86Y的激酶活性无明显改变;RIPK3W85A的自磷酸化减少,但不影响MLKL的磷酸化与寡聚化。结论·Q84、W85与D86是调节RIPK3激酶活性的关键氨基酸位点,RIPK3W85A的激酶活性减弱,但其对MLKL无影响。