晚期糖基化终末产物对糖尿病小鼠角膜树突状细胞活化的影响及作用机制

摘要

目的探讨晚期糖基化终末产物（AGEs）对糖尿病小鼠角膜中树突状细胞（DCs）活化功能的影响及其作用机制。方法将6周龄小鼠随机分为正常对照组（A组）和1型糖尿病组（B组）,分别连续5 d腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或链脲佐菌素（60 mg/kg）,通过Western Blot方法检测A、B组小鼠角膜中AGEs蛋白的表达水平。利用10μg/L白细胞介素4（IL-4）和20μg/L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）体外诱导小鼠骨髓源树突状细胞（BMDCs）,将其随机分为C、D、E、F、G、H组,C、F组为空白对照组,培养于1640培养基中,D组为牛血清白蛋白（BSA）组,培养于含200 mg/L BSA的1640培养基中,E、G组为AGE-BSA组,培养于含200 mg/L AGE-BSA的1640培养基中,H组为瑞沙托维（TAK-242）组,用5μmol/L TAK-242预处理1 h后,加入同G组的培养基。采用ELISA方法检测C、D、E、F、G、H组细胞上清液中干扰素-β（IFN-β）蛋白的含量;采用实时荧光定量PCR技术检测C、D、E、F、G、H组BMDCs中IFN-β、CXC基序趋化因子10（CXCL10）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-12p35（IL-12p35）mRNA的表达量;采用Western Blot方法检测C、D、E、F、G、H组BMDCs中干扰素调节因子3（IRF3）和p65蛋白的磷酸化水平。将小鼠随机分为I、J、K组,I组为在A组小鼠处理的基础上结膜下注射溶剂,J组为在B组小鼠处理的基础上结膜下注射溶剂,K组为在B组小鼠基础上结膜下注射TAK-242,构建小鼠角膜上皮刮除模型,通过荧光素钠染色观察TAK-242对小鼠角膜上皮损伤修复的影响。结果与A组小鼠相比,B组小鼠角膜内AGEs蛋白的表达水平明显升高。E组细胞上清液中IFN-β蛋白水平及BMDCs中IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35 mRNA的水平均明显高于C、D组（F=46.98～4 251.15,P＜0.05）;E组BMDCs中磷酸化IRF3（p-IRF3）、p-p65蛋白表达水平也均明显高于C、D组。H组细胞上清液中IFN-β蛋白水平及BMDGs中IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35 mRNA的水平均明显低于G组（F=23.01～1 257.10,P＜0.05）;H组BMDCs中p-IRF3及p-p65蛋白表达也明显低于G组。在小鼠角膜上皮刮除后24和40 h, J组上皮愈合较I组延迟,K组上皮愈合较J组明显增快（F=5.85、4.89,P＜0.05）。结论 AGEs可能通过激活TLR4信号通路促进糖尿病小鼠角膜内DCs的活化。