P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

摘要

目的 :通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质 1(Telomericrepeatbindingprotein 1,TRBP1)与P5 3的体外结合 ,探讨P5 3通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制。方法 :谷胱甘肽S转移酶 (glu tathioneS transferase ,GST)和人P5 3 GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽 SepharoseTM4B纯化后 ,和人乳腺癌细胞MCF 7细胞蛋白进行体外结合反应 (pulldown) ,Westernblot检测反应物中P5 3和TRBP1的结合。融合蛋白中人P5 3包括野生型 (1～ 393)、C端缺失体P5 3N5 (2～ 2 93)、N端缺失体P5 32C(95～ 393)、175单个氨基酸突变体P5 3R175H(R→H)。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R2 5 0染色显示 ,纯化的GST和 4种P5 3 GST蛋白纯度在 90 %以上 ,且分子量与预计的完全一致。TRBP1的Westernblot显示 ,野生型P5 3和P5 3 R175H均能沉淀MCF 7中的TRBP1,且结合力相似 ,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用。与野生型P5 3和P5 3R175H相比 ,P5 32C与TRBP1的结合力明显增加 ,P5 3N5与TRBP1的结合力明显减弱。结论 :P5 3和TRBP1可以直接体外结合 ,P5 3的C端 (2 93～ 393)是与TRBP1结合的结构域。P5 3和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关。