高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响

摘要

目的:观察高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞株第5~10代[HMr SV5,DMEM/F12培养基含10%(体积分数)胎牛血清],观察1.5%、2.5%、4.25%(质量分数)葡萄糖腹膜透析液(dextrose)及线粒体呼吸链复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮(rotenone),线粒体呼吸链复合酶Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA),线粒体呼吸链复合酶Ⅲ抑制剂抗霉素A(antimycin A)对细胞IL-1β表达的影响(免疫印迹);通过小RNA干扰技术下调NLRP3的表达,免疫印迹分析4.25%高糖腹膜透析液作用下细胞IL-1β的表达;通过白藜芦醇(resveratrol,RSV)诱导自噬,3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、自噬相关蛋白5(autophagy related gene 5,ATG5)siRNA、自噬相关蛋白(Beclin1)siRNA抑制自噬,流式细胞仪分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS),免疫印迹分析IL-1β的表达。结果:对照组、1.5%高糖腹膜透析液、2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮(10μmol/L)、抗霉素A(50 mg/L)、噻吩甲酰三氟丙酮(10μmol/L)各组细胞上清IL-1β的相对表达依次为0、0.175±0.082、0.418±0.163、2.357±0.288、2.642±0.358、3.271±0.462、0.123±0.091,提示2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮、抗霉素A作用细胞IL-1β表达明显升高,应用NLRP3 siRNA可阻断上述效应;此外,对照组、阴性对照siRNA(negative control,NC siRNA)、RSV(50μmol/L,诱导自噬)、3-MA(10 mmol/L,抑制自噬)、ATG5 siRNA(抑制自噬)、Beclin1 siRNA(抑制自噬)各组总线粒体荧光强度分别为1.76±0.42、1.83±0.55、1.85±0.62、7.36±0.92、5.35±0.77、5.06±0.62,超氧化线粒体荧光强度分别为821.68±95.12、868.15±102.82、723.39±92.56、1 660.08±113.65、1 433.01±107.24、1 562.36±112.88,结合免疫印迹结果,提示抑制自噬可增强线粒体ROS产生和提高IL-1β表达,诱导自噬对ROS、IL-1β无明显影响。结论:长期应用高糖腹膜透析液,腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β持续激活,实时启动自噬可能成为干预NLRP3-IL-1β持续激活、延缓腹膜透析腹腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点。