花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

摘要

[目的]克隆花斑裸鲤GeHSP70基因,并进行生物信息学分析;研究正常和Cu2+胁迫条件下GeHSP70的表达模式.[方法]采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长eDNA,分析其生物信息学特征.采用Real-time PCR技术分析正常和0.01 mg/L Cu2+胁迫(胁迫0,12,24,48 h)条件下GeHSP70 mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况,并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平.[结果]花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387 bp,由123 bp的5＇-UTR、592 bp的3＇-UTR和672 bp的编码区构成,编码223个氨基酸;GeHSP70蛋白是疏水性蛋白,分子质量为11.15 ku,等电点为5.01,包含2个HSP70家族的特征序列:IDLGTTYS(11-18位氨基酸)和IFDLGGGTFDVSIL(199-212位氨基酸).GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高(93％),在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支,显示出高度保守性.Real-time PCR结果表明,正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高,其次是肝脏,在脑和鳃组织中表达量较低;随着0.01mg/L Cu2+胁迫时间的延长,花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70 mRNA表达量先升后降,在24 h表达量最高,而脑组织的表达量持续升高;GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降,表明Cu2+能够诱导GeHSP70的表达.[结论]成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70 eDNA全长,在0.01 mg/L Cu2+胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答,表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物.