重组GGPPS腺病毒载体的构建及其调节肝星状细胞活化的研究

摘要

目的:构建携带人源ggpps基因的重组腺病毒并用其研究GGPPS对人肝星状细胞的活化作用.方法:利用PCR方法扩增ggpps基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成穿梭质粒pAdTrack-CMV-GGPPS.测序正确后,经PmeI单酶切线性化的pAdTrack-CMV-GGPPS与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组.经PacI酶切鉴定正确后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-GGPPS颗粒.利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生.用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并用免疫蛋白印迹和实时荧光定量PCR方法鉴定目的基因的表达.然后利用该病毒感染人肝星状细胞LX-2,观察对肝星状细胞的活化以及细胞外基质合成的影响.结果:成功地构建了携带ggpps基因的重组腺病毒,得到的病毒滴度经TCID50法检测为2.5×109PFU/mL.该病毒能够在人源的肝脏细胞中成功表达GGPPS蛋白.在LX-2细胞中过量表达GGPPS可以促进肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化成表达平滑肌肌动蛋白α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF),同时检测到胞外基质成分纤连蛋白(Fibronectin,FN)的表达量显著增加.结论:成功构建的重组GGPPS腺病毒能促进肝星状细胞的活化.