绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带问充质干细胞的实验研究

摘要

目的构建同时表达绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因和人胰岛素（insulin，INS）基因的重组腺病毒载体pAdxsi．EGFP—INS，并感染人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemeels，hUCMSCs），观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用。方法用EcoRI／XhoI将胰岛索基因从原始质粒上切下，定向插入至pShuttle—CMV—EGFP穿梭质粒，将验证正确的pShuttle—CMV—EGFP—INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上，构建pAdxsi—EGFP—INS重组腺病毒载体，用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞，扩增纯化重组腺病毒，测定病毒滴度。原代培养hUCMSCs，分别用pAdxsi—EGFP—INS（感染组）及pAdxsi—EGFP（对照组）腺病毒感染hUCMSCs，观察荧光蛋白的表达情况，成脂诱导剂诱导分化，油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用。结果成功构建pAdxsi—EGFP．INS重组腺病毒载体，包装、纯化后获得滴度达4×10-11 pfu／ml的重组腺病毒。分离获得hUCMSCs并传代、纯化，pAdxsi-EGFP—INS感染hUCMSCs后，EGFP—INS在胞浆及胞核表达；成脂诱导培养18d后，感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞，而对照组细胞含有少量较大的脂滴，感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组。结论获得的pAdxsi—EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs，为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用，追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。