三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的表达

摘要

Crustin主要分布于甲壳动物中,是一种富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,在甲壳动物的先天免疫系统中发挥重要作用.根据crustin的一级结构特征可以将其分为不同的类型,本文以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的PtCrustin2成熟肽为研究对象,通过构建毕赤酵母表达系统,以期实现PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达.首先,从其鳃中提取总RNA,通过RT-PCR得到编码PtCmstin2成熟肽的cDNA(mPtCrustin2),并在其5'和3'端分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶位点;然后将此片段与表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPI C9 K-mPtCrustin2;电转入毕赤酵母GS115细胞后,以不同浓度的G418筛选到高拷贝酵母转化子,经0.5％甲醇诱导表达和固化金属离子亲和层析(IMAC)分离,获得了纯化的重组体mPtCmstin2,Tricine-SDS-PAGE分析显示其分子量约10.5 kDa;抑菌实验证明重组体mPtCrustin2对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有一定的抑菌效果.本研究首次实现了三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为进一步研究提供参考.