β-arrestin2抗基因RNA表达载体的构建及其基因沉默效应鉴定

摘要

目的吗啡耐受与神经元μ阿片受体持续脱敏感化有关,而μ阿片受体调控蛋白β-arrestin2在其中起着关键性作用,因此β-arrestin2有可能成为抑制吗啡耐受状态的有效靶点。文中构建携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体pGPU6/GFP/agRNAs,并评价其用于基因沉默研究的可行性。方法根据β-arrestin2基因转录起始位点序列,从-14处开始至+13处结束,每隔一个碱基,依次合成9条21个碱基长度的抗基因RNA片段,并分别构建入质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo。利用脂质体Lipofectamine介导的基因转染技术,分别将各个表达载体转染NG108-15细胞,于转染后第5天分别取转染不同抗基因RNA片段的细胞提取总RNA,应用realtime PCR和Western blot检测细胞β-arrestin2的表达,评价其基因沉默效应。结果筛选出1个表达具有基因沉默效应的抗基因RNA表达载体pGPU6/GFP/Arrb9。Realtime PCR结果显示NG108-15细胞转染该片段后,β-arrestin2 mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05),下降程度达95%。结论携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体可有效下调NG108-15细胞β-arrestin2的表达,实现基因沉默效应。