蛋白磷酸酶2C(PP2C)的表达、纯化与催化活性

摘要

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA,经RT-PCR,扩增出蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因,并构建了pUCm-T载体.经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后,将pUCm-T中的PP2C基因插入pET28a载体中,构建了表达载体pET28a-PP2C,并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达.经测定,该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为:诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L,37 ℃,诱导时间为20 h.在此条件下,PP2C实现了高效表达,表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%,其中在裂解上清液、沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%.经SDS-PAGE分析,表达产物分子量约为42 000.应用Ni-NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化,收率达80.5%,纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.