脂肪间充质干细胞对脑出血大鼠自噬的影响及机制探究

摘要

目的探讨脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)对脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)大鼠自噬的影响并探讨其可能的作用机制。方法在无菌环境下分离健康SD大鼠腹股沟周围脂肪,体外培养ADSCs,并培养至第4代,应用流式细胞仪对ADSCs表面标志物进行测定。雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham)、ICH组、ADSCs组。ICH组和ADSCs组大鼠建立ICH模型,Sham组同样的方法建立模型,但不注射自体血。建模术后2 h,ADSCs组经右侧纹状体区域注射给予5μL细胞悬液(1×10^(5)个细胞),Sham组和ICH组给予等体积的生理盐水。建模成功后分别于第12 h、1 d、3 d、5 d、7 d对大鼠进行Longa神经功能评分,处死大鼠后,HE染色观察大鼠脑组织病理改变、尼氏染色观察未受损神经元数量、测定脑组织水含量、免疫组织化学染色法检测细胞内自噬相关蛋白人重组自噬效应蛋白(recombinant human beclin 1,Beclin1)和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(in vitro kinase assay for serine/threonine protein kinase AKT/mammalian target of rapamycin,AKT/mTOR)信号通路磷酸化的表达情况。蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测1 d、3 d脑组织内LC3、Beclin1、AKT/mTOR信号通路磷酸化蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测所培养的大鼠ADSCs中黏附分子CD29、CD90呈阳性表达,CD45呈阴性表达。与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织病理症状均明显增加,Longa评分、脑组织含水量、受损神经元数量,自噬相关蛋白LC3和Beclin1、AKT/mTOR信号通路磷酸化阳性细胞表达及蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)。与ICH组相比,ADSCs组大鼠脑组织病理症状均明显减轻,Longa评分、脑组织含水量、受损神经元数量明显降低(P<0.05),自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达水平明显下降(P<0.05),AKT/mTOR信号通路磷酸化阳性细胞表达及蛋白表达水平明显上调(P<0.05)。结论ADSCs移植治疗脑出血可发挥神经保护作用,这种作用可能与通过激活AKT/mTOR信号通路抑制ICH大鼠细胞自噬水平进而减轻大鼠脑损伤程度有关。