非核糖体肽合成酶腺苷化结构域在E.coli中的表达及底物特异性分析

摘要

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9产生的抗菌肽(Brevibacillin,BBL)是一种非核糖体多肽,由非核糖体肽合成酶催化合成。本研究所用基因是从侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)S62-9质粒基因组中克隆的一个非核糖体肽合成酶的腺苷化结构域(Nonribosomal peptide synthetase adenylation,NRPS-A)基因,根据此NRPS-A基因构建了pET21b-N1、pET21b-B2、pET22b-N1、pET22b-N3四个重组表达载体。将以上重组表达载体分别转化E.coli BL21、E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Origami B(DE3)受体细胞,并用1 mmol/L异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在16°C 200 r/min下进行诱导,将诱导产物用SDS-PAGE检测分析。结果显示,4种重组载体在E.coliBL21中均无表达,在E.coliRosetta(DE3)大量表达但均以包涵体形式存在,在E.coli Origami B(DE3)均表达,但只有pET22b-N3这一重组表达载体出现了可溶性融合蛋白。可溶性融合蛋白对赖氨酸有较高的腺苷化活性,表明该A结构域负责抗菌肽BBL中的赖氨酸的识别和上载。该研究结果不仅为其它NRPS-A域的可溶性表达提供了方法,同时为研究抗菌肽BBL的生物合成机制提供依据。