慢病毒载体介导siRNA沉默Id-1通过ERK1/2信号通路抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长

摘要

目的 构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1,观察其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其对ERK1/2信号通路的影响. 方法 构建合成特异性针对Id-1基因的siRNA慢病毒载体,转染肝癌HepG2细胞系,经半定量RT-PCR鉴定筛选沉默效果最佳的细胞系,于倒置荧光显微镜(×400)下观察转染前后细胞的形态学变化.取细胞浓度为5×106 mL1的干扰效率最佳的稳定转染细胞系、稳定转染空载体病毒细胞系及正常HepG2细胞系悬液各0.2 mL,分别注射到转染实验组、阴性对照组及空白对照组的裸鼠右腋皮下,每周测量肿瘤体积及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长曲线,28d后处死裸鼠,制作肿瘤组织标本,行常规病理检查,采用半定量RT-PCR及Western-blot方法检测肿瘤组织Id-1,ERK1/2的mRNA和蛋白的表达水平及p-ERK1/2的蛋白表达水平. 结果 倒置荧光显微镜显示,转染前后细胞形态学变化不明显.经半定量RT PCR筛选出Id-1基因的siRNA慢病毒载体的最佳细胞系为sh31,与稳定转染空载体病毒细胞系相比,目的基因Id-1的表达降低了80％0以上,与未干扰的HepG2细胞相比降低了60％;转染细胞皮下接种后,转染组最终瘤体大小明显小于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).半定量RT-PCR显示,转染组肿瘤组织的Id-1及ERK1/2 mRNA分别为(0.389±0.058)及(0.475±0.079),均明显低于阴性对照组[(0.845±0.113),(0.977±0.082)]和空白对照组[(0.917±0.083),(0.978±0.056)](均为P＜0.05).Western-blot检测显示,转染组的Id-1及p-ERK1/2蛋白均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05). 结论 Id 1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体通过靶向抑制Id-1的表达,明显抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,推测Id 1可能通过调节ERK1/2 MAPK信号通路参与肝癌的发生发展.