抗ADAR1锤头状核酶的计算机设计及其可控真核表达载体的构建

摘要

目的 :选择针对ADAR1mRNA的 5′非编码区 (NCR)和翻译起始区的锤头状核酶 (ribozyme ,Rz)切割位点 ,构建针对ADAR1的Rz可诱导真核表达载体 ,旨在knockdownADAR1基因 ,开展ADAR1基因功能的研究 .方法 :应用计算机辅助设计 ,根据能量最低化原理 ,以ADAR1mRNA的 5′NCR和翻译起始区为靶序列 ,预测其二级结构 ,选择理想的Rz切割位点 ,设计并合成锤头状核酶 .采用亚克隆法首先将人工合成的RzDNA序列插入原核载体p1.5的XbaⅠ和KpnⅠ位点获得Rz原核表达质粒pRz 6 13;再将pRz 6 13中ADAR1Rz基因连同其两端的自剪切Rz序列一起克隆入可诱导真核表达载体pTRE的SacⅡ和EcoRⅠ位点得到真核表达质粒pRz ADAR1;通过酶切电泳和测序检查质粒重组后序列情况 .结果 :选出ADAR1mRNA的第 2 0 8位为Rz切点 ,设计并合成了RzDNA序列 .所构建的pRz ADAR1经酶切电泳鉴定显示 ,插入Rz序列大小约为 180kb ,和预期结果相同 ;经测序证实Rz序列正确 .结论 :利用计算机辅助设计 ,成功构建了针对ADAR1锤头状Rz可诱导真核表达载体pRz ADAR1.