基于免疫磁珠技术快速富集牛支原体方法的建立

摘要

为建立牛呼吸系统疾病主要病原-牛支原体的快速富集方法,试验采用PCR方法对牛支原体P48基因扩增,构建重组质粒pET32a（+）-P48。将重组质粒进行原核表达并进行纯化。将纯化的牛支原体P48蛋白作为免疫原与弗氏佐剂混合乳化免疫家兔,获得抗牛支原体P48蛋白的高免血清,同时对高免血清进行纯化。将纯化后多克隆抗体与NHS磁性微球进行耦联,制备免疫磁珠。对耦联缓冲液、抗体浓度进行优化。从富集牛支原体的时间、敏感性和特异性三方面对免疫磁珠进行评价。结果表明:成功地扩增出大小约1 407 bp的P48基因并表达出大小约62 ku的可溶性重组蛋白。制备的多克隆抗体的效价高达1∶64 000,且具有很高的特异性;抗体与磁珠耦联的最佳介质为2-吗啉乙磺酸;抗体质量浓度为200μg/mL与磁珠的耦联率最高;免疫磁珠在15 min之内就能够富集到牛支原体,且富集到浓度为1×10-3ccu/mL,具有良好的特异性。说明免疫磁珠技术能够快速富集牛支原体,为分离鉴定牛支原体提供一种新的可行性的方法。