含人神经营养素-3的重组腺病毒的高效制备

摘要

目的 采用改良的细菌内同源重组法快速高效构建含人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒,为其用于神经性聋的在体研究做准备.方法 将人全长NT-3基因亚克隆至带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的穿梭质粒pshuttle-IRES-hrGFP-1上,用电穿孔法使线性化的重组穿梭质粒与预转入腺病毒骨架pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183-AD-1同源重组,脂质体法转染AD293细胞并大量扩增、柱层析纯化得到重组腺病毒pAdeasy-NT-3,GFP测定病毒滴度.结果 PCR检测证明人NT-3已整合入腺病毒基因组并表达;Western blot证实在感染重组腺病毒pAdeasy-NT-3的Hela细胞中有相应NT-3蛋白表达;病毒滴度分别为pAdeasy-NT-3 109U/ml、pAdeasy-hrGFP1010U/ml.结论 利用新型的腺病毒载体Adeasy XL系统可以快速构建同时表达GFP和NT-3的重组复制缺陷型腺病毒pAdeasy-NT-3,柱层析纯化法能制备高纯度的病毒.