内皮特异性表达人血栓调节蛋白的载体构建及体外表达

摘要

血栓调节蛋白(thrombomodulin,TBM)是血管内皮细胞表达的一种膜蛋白,在凝血过程中起到关键作用.已有研究表明,异种移植时由于分子不匹配造成猪(Sus scrofa)TBM不能有效地调节凝血而形成血栓,而在猪的血管内皮细胞表达人TBM可能有助于调节凝血.本研究利用猪源TBM启动子调控人(Homo sapiens)TBM基因(Human thrombomodulin,hTBM),采用基因抓捕的方法获得了7和9kb猪血栓调节蛋白(Pig thrombomodulin,pTBM)启动子,构建两种表达hTBM的载体,命名为p7K(pTBM)-hTBM和p9K(pTBM)-hTBM.体外转染猪内皮细胞、耳成纤维细胞及肾细胞,通过RT-PCR、qRT-PCR和Western blot检测其特异性表达.RT-PCR显示,7和9kb两种启动子都能特异调控hTBM在血管内皮表达;qRT-PCR和Westernblot显示,9kb启动子的启动活性高于7 kb (P＜0.05).本研究表明,9 kb pTBM启动子能够驱动hTBM在血管内皮特异性高效表达,为创建血管内皮特异高表达人抗凝血因子的转基因猪提供了基础资料,有助于克服异种移植分子不匹配出现的凝血失调.