含拉米夫定耐药基因的乙型肝炎病毒全基因组载体的构建及鉴定

摘要

目的建立含拉米夫定耐药基因的乙型肝炎病毒(HBV)全基因组载体,为进一步建立耐药细胞模型奠定基础。方法采用基因扩增、重组和克隆的方法,提取HBV-DNA进行扩增,插入pBluescript-SK(-)载体,酶切和测序鉴定重组质粒含有HBV-DNA全基因组后,以该重组质粒的多聚酶逆转录酶区为模板,设计引入突变位点的引物,聚合酶链反应(PCR)进行定点突变,突变产物经DpnⅠ消化后,转化到感受态细胞DH5α,最后将提取的突变质粒进行测序鉴定。结果凝胶电泳分析血清HBV-DNA扩增可见3.2kb条带,HBV-DNA和pBluescript-SK(-)载体连接后可见6.9kb目的条带,该重组质粒双酶切后可见3.2kb和2.9kb目的条带,突变PCR产物经DpnⅠ消化后可见明显条带。突变前质粒测序显示含有HBV基因型为C型血清型为adr的全基因组,突变后测序证实存在HBV逆转录酶173、180、204位点的预期碱基突变。结论通过测序鉴定,成功构建了拉米夫定耐药HBV全基因组载体。