两种磁性纳米颗粒介导人sFIt-1基因片段转染的比较

摘要

目的:比较羧甲基化葡聚糖(carboxymethylated dextran,CMD)与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)纳米磁颗粒作为基因载体对可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFIt-1)胞外第2-3区sFIt-1 (2-3)基因片段转染的差异.方法:通过磁颗粒载体将构建的真核表达质粒pcDNA 3.1/sFIt-1(2-3)的基因片段转染入人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中,检测各组的转染效率和对细胞增殖能力及凋亡的影响.实验分为CMD磁颗粒(CMD-MAG)组、PEI磁颗粒(PEI-MAG)组、单纯PEI组和未转染对照组,用第3～5代处于对数生长期的HUVEC为转染对象.在相同外界磁场条件下分别以N/P(聚合物中的氨基基团与DNA中磷酸基团的摩尔比)为10,15,20,25,30的PEI/DNA/CMD-MAG复合物、PEI/DNA/PEI-MAG复合物转染HUVEC,并以不加磁场下单纯PEI/DNA复合物转染的和未经转染的HUVEC作为对照.24h后倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪检测以上述不同方法转染了增强型绿色荧光蛋白质粒(pcDNA3.1-EGFP)的细胞绿色荧光表达百分率以反映目的基因片段sFIt-1(2-3)的转染率;RT-PCR法和Western blot法检测转染pcDNA3.1/sFIt-1(2-3)后sFIt-1(2-3) mRNA和蛋白的表达.通过MTT法观测各组细胞的生长情况,计算各组细胞的相对增殖百分率;通过Hoechst染色法观察各组细胞的凋亡百分率,以此对比不同磁颗粒载体转染后对细胞的影响.结果:在N/P为20时,各组GFP的转染率最高,且CMD磁颗粒组各N/P时转染率均高于其他组;转染pcDNA 3.1/sFIt-1(2-3)后24h,CMD-MAG组sFIt-1(2-3)的mRNA和蛋白的表达均明显高于其他组;CMD磁颗粒转染组细胞增殖能力与对照组无明显差异,而PEI磁颗粒组、PEI组转染组细胞增殖能力均明显降低;CMD磁颗粒转染组约有5%细胞发生凋亡,PEI磁颗粒组凋亡细胞百分数约为20%～30%,PEI组约为50%.结论:CMD纳米磁颗粒可作为载体实现目的基因片段的高效率转染;在转染率和细胞毒性等方面CMD纳米磁颗粒均优于PEI纳米磁颗粒,可作为sFIt-1基因片段转染和眼底新生血管性疾病基因治疗的载体.