DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

摘要

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalⅠ酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4.55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA(1、2、3)及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。