利用CRISPR/Cas9系统构建STING基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系及其功能验证

摘要

本研究通过CRISPR/Cas9系统构建STING基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(PAM),并验证STING敲除细胞介导IFN-Ⅰ产生和抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)感染的功能变化。针对猪STING基因靶向设计向导RNA(sgRNA),将连接sgRNA的pX-458质粒转染PAM细胞,利用定向筛选和有限稀释法建立STING基因敲除细胞克隆。利用DNA测序和Western-blot方法分别对所获细胞克隆的STING基因和蛋白表达进行鉴定。通过RT-qPCR和Western-blot对STING敲除细胞进行功能鉴定,通过荧光显微镜观察STING敲除对HSV-Ⅰ复制的影响。扩增STING基因序列的测序结果表明,在该STING基因编辑位点产生碱基缺失移码突变,Western-blot结果显示,敲除细胞中STING蛋白表达消失。经poly(dA:dT)或2′3′-cGAMP刺激后,与正常PAM细胞相比,STING敲除的PAM细胞中刺激诱导的IFN-β和ISG56 mRNA表达下降;刺激诱导的P-TBK1、P-IRF3和ISG56蛋白表达也显著下调;同时HSV-Ⅰ复制水平显著上调。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了STING基因敲除的PAM细胞克隆,验证了STING敲除对诱导IFN-Ⅰ相关信号及抗HSV-Ⅰ感染的影响,为进一步研究STING在猪天然免疫中的作用提供了细胞工具和手段。