内质网应激介导的凋亡在糖尿病ApoE^(-/-)小鼠内膜钙化中的作用

摘要

目的观察内质网应激(ERS)介导的凋亡在糖尿病动脉粥样硬化(As)性载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠内膜钙化启动中的作用。方法 6周龄雄性Apo E-/-小鼠,给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40mg/(kg·d),连续5天。2周后血糖水平>3000 mg/L的小鼠纳入本研究,并由普通饮食转为半合成型高脂饮食(HFD),同时给予尾静脉注射羧甲基赖氨酸(CML)10 mg/(kg·d),连续4个月。在转换高脂饮食和给予CML注射后的0个月(0月组,n=10)、2个月(2月组,n=10)和4个月(4月组,n=10)时对小鼠实施安乐死,进行相关检测与分析。结果病理形态学研究证实STZ-CML-HFD联合处理2个月后,糖尿病ApoE^(-/-)小鼠可形成早期的As斑块,4个月后形成典型的晚期As内膜钙化。主动脉壁平滑肌细胞固有表型SM22α逐渐丢失,而成骨表型骨形成蛋白2、核心结合因子α1、碱性磷酸酶的表达与活性则增加。主动脉壁CML沉积信号和糖基化终产物受体(RAGE)表达主要局限于粥样斑块内。Western blot检测显示,随着糖尿病Apo E-/-小鼠病程的延长,主动脉壁CML、RAGE、CD36表达显著上调,而胆固醇外流调控子三磷酸腺苷结合盒转运体A1先出现代偿性增加继而又减少至基线附近。TUNEL染色与Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色发现,随着糖尿病As的演进,斑块内细胞凋亡率明显增加。定位分析显示ERS伴侣分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EPB同源蛋白(CHOP)主要分布在As病变区的脂质池内,而且相对于CHOP,4月组GRP78的分布位置似乎更倾向于脂质池的基底部。Western blot半定量分析发现,ERS相关指标GRP78、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶、磷酸化eIF2α、活化转录因子4和CHOP的表达随着动物实验时间的延长均呈上调趋势。结论 STZ-CML-HFD联合干预4个月可成功诱导ApoE^(-/-)小鼠形成糖尿病As钙化。CML/RAGE可能首先启动了斑块ERS介导的凋亡,继而诱发了钙化级联信号。