RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

摘要

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMo V cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMo V病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到c DNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的c DNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体p FGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMo V的RNAi植物表达载体p FGC5941-C2和p FGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。