敲除PPK基因对幽门螺杆菌逃避巨噬细胞免疫清除的影响

摘要

目的:研究敲除多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)基因后对幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)逃避巨噬细胞免疫清除的影响.方法:通过同源重组的原理构建H.pylori PPK敲除菌株.提取PPK敲除菌株体内多聚磷酸盐,转化为ATP进行定量,并与野生型菌株内多聚磷酸盐水平进行比较.将PPK敲除菌株及野生型菌株分别与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,比较存活的H.pylori数量.结果:成功构建敲除PPK的H.pylori菌种.Western blot显示该菌无PPK蛋白表达.对敲除PPK的H.pylori菌株中的多聚磷酸盐定量结果显示,其内PP含量为0.46±0.25nmol Pi/mg Protein,显著低于G27野生菌种(175.33±21.22nmol Pi/mg Protein,P<0.01).将该菌株与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,2h时间点,G27及G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内的存活无显著差异;而在24h时间点,G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内的存活率显著低于野生型G27菌种,巨噬细胞内的BacLightkit染色结果显示,G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内获得染色的活菌显著低于野生型G27菌种.结论:PPK是H.pylori合成多聚磷酸盐的关键酶.敲除该基因后,H.pylori合成多聚磷酸盐的能力显著下降,其逃避巨噬细胞清除的能力明显减弱.