原代睾丸支持细胞分离纯化及双室培养模型的建立

摘要

[目的]通过建立双室培养模型,为探讨毒物或药物对睾丸支持细胞作用机制提供一个合适的体外研究方法。[方法]18d龄雄性SD大鼠,脱颈椎处死后,无菌条件下取睾丸组织,经胰蛋白酶和胶原酶二步消化后获得支持细胞,经接种、纯化和鉴定,获得纯度>95%支持细胞。培养液A为DMEM培养基和F12培养基按照1:1比例用去离水配制,每升培养基中含有20万单位青霉素和0.2g链霉素,用2%的碳酸氢钠调整pH值为7.2左右。培养液B为培养液A中加入维生素A、E(200ng/ml)和胰岛素(2μg/ml)。培养液C为B培养液中再加入卵泡刺激素(100ng/ml)和睾丸酮(10-8mol/L)。将制备好的支持(Sertoli)细胞混悬液按2.5×106个/ml浓度接种于24孔培养板内,培养条件为35℃(睾丸细胞的适宜温度),2%CO2恒温静止培养。测定3种不同培养液中培养的支持细胞形成的跨细胞上皮电阻值(transep-ithelialelectricalresistance,TER)。[结果]培养液加入维生素A、E和胰岛素后,支持细胞形成的TER有所升高,而培养液在加入睾丸酮和卵泡刺激素后,Sertoli细胞形成的TER则显著升高。培养第1天3种培养液中培养的Sertoli细胞形成的TER分别为33.85、31.38和34.26Ω/cm2,培养第13天分别为198.53、289.91和707.50Ω/cm2。[结论]Sertoli细胞双室培养模型可模拟体内状态的“血睾屏障”,为体外研究雄性生殖毒性机制提供一个合适模型。