Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

摘要

目的　构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法　利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果　酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论　逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。