高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的建立

摘要

目的应用荧光方法建立、优化、评价艾滋病病毒1型(HIV-1)蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,并用于大规模样品筛选。方法将p100w表达质粒转化E.coli细菌细胞,使其表达包涵体形式的HIV-1蛋白酶融合蛋白,制备纯化自剪切后成熟的HIV-1蛋白酶。通过测定Km值及已知HIV蛋白酶抑制药的IC50对酶进行鉴定。优化酶反应体系,评价模型的可靠性。建立、比较HPLC酶切分析法及荧光底物法两种测定酶活性方法。结果建立了高通量HIV-1蛋白酶筛选模型,经优化减少酶及底物用量,降低了成本。在模型可靠性评价中,Z因子达到0.786以上。在对9000个微生物发酵产物样品的筛选中,验证了方法的可应用性,并获得阳性菌株41个。结论所建立的荧光方法高通量筛选模型稳定可靠,效率比传统的HPLC酶切分析法提高,适用于大规模筛选HIV-1蛋白酶抑制剂。