实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞癌中Dicer mRNA的表达

摘要

目的:建立Dicer mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR)系统,检测肝癌细胞系与20例原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)组织中Dicer mR-NA的表达水平。方法:根据Dicer mRNA的全序列设计特异性引物,结合荧光染料SYBR GreenⅠ,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,进行熔解曲线分析排除非特异性扩增,根据标准品绘制标准曲线,由软件自动计算出待测样品Dicer mRNA的准确含量,并以Dicer mRNA和18S rRNA含量的比值作为Dicer表达水平的指标。结果:该方法检测的线性范围为5×102~5×109copies/μl,样本的批内变异系数与批间变异系数为4.13%~19.72%和6.25%~18.76%。Dicer mR-NA在HBV阳性肝癌细胞系HepG2.2.15和HBV阴性肝癌细胞系HepG2的表达水平明显低于正常肝细胞系WRL-68(P<0.05);在PHC组织的表达水平明显低于癌旁配对组织(P<0.05)。结论:该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性。Dic-er mRNA表达量在肝癌细胞系和PHC组织中的检测为以后更好的研究PHC的发病机制奠定了理论基础。