犬2型腺病毒E3区的克隆及其缺失改造

摘要

为构建可用于插入外源基因的犬 2型腺病毒 (CAV - 2 )E3区表达载体 ,用KpnI对CAV - 2DNA进行酶切 ,回收含E3区的KpnIB片段并将其克隆到质粒pBluescriptIIKS(+)中 ,获得了正向和反向插入的重组质粒 ,并对E3区进行了序列测定。根据E3区两末端的序列合成了两对突变引物 ,每对引物分别在E3区的 2 4 986bp及 2 6 36 0bp处各引入一个BglⅡ酶切位点。以E3区正向插入的重组质粒pBE3- 2为模板 ,分别用两对突变引物经PCR法连续进行两次点突变 ,通过BglII酶切 ,最终筛选到在E3区的首尾两端各引入一个BglII酶切位点的突变重组质粒pBEM。利用BglII酶切将E3区切除约 1 4kb的片段 ,然后在缺失部位插入了人工接头 ,接头设计了 5个单一酶切位点 ,得到的pBE3L质粒可用于外源基因的插入。