人颗粒溶素活性片段原核表达载体的构建与鉴定

摘要

目的构建人颗粒溶素(GNLY)活性片段原核表达载体。方法采用RT-PCR技术从健康人外周单个核细胞中扩增出颗粒溶素活性片段cDNA,将其与表达载体pGEX-4T-1经限制性核酸内切酶双酶切后连接,转化E.coliBL21,挑取阳性菌落,抽提重组质粒并鉴定。IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化,SDS-PAGE分析表达和纯化结果,抑菌圈法鉴定表达产物的活性。结果重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶素活性片段cDNA。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量29000处出现一明显条带,与理论结果相符。抑菌试验表明,融合蛋白分子凝血酶切产物对革兰阳性的金黄色葡萄球菌ATCC25938有抑制作用。结论已成功构建了人颗粒溶素活性片段原核表达载体,为进一步研究其抗菌、抗肿瘤作用奠定了基础。