细菌内同源重组构建和制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒

摘要

利用细菌内同源重组法构建制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒。先自过氧化氢酶质粒载体pZeoSV2-Cat中酶切出过氧化氢酶cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-Cat,再转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆菌BJ5183,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat;用PacI酶切线性化pAdEasy-1-Cat,转染Ad-293细胞,包装成重组腺病毒颗粒;用氯化铯超速梯度离心纯化获取高滴度的重组腺病毒AdCat。结果发现,线性化的pShuttle-CMV-Cat转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆茵BJ5183,24 h后获得了30％阳性重组质粒克隆,经酶切鉴定说明pAdEasy-1-Cat构建成功。重组质粒经Ad-293细胞包装后产生的重组腺病毒经聚合酶链反应检测表明含有目的基因。氯化铯纯化获取的重组腺病毒滴度为4.12×1015OPU/L。说明应用细茵内同源重组能快速构建含过氧化氢酶基因的重组腺病毒载体pAdEas-1-Cat,可高效制备均一的高滴度重组腺病毒。