杉木茎段cDNA-AFLP反应体系的优化

摘要

本研究以杉木茎段为材料,对RNA提取、反转录方法、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等步骤进行了分析,探讨了影响杉木茎段cDNA-AFLP分析体系的各种因素,建立并优化了杉木茎段cDNA-AFLP反应体系。结果表明:采用Chang等(1993)的CTAB-LiCl法稍加改进后提取RNA,得到的杉木茎段总RNA样品较为完整,纯度较高;Primescript反转录酶结合置换合成法得到的cDNA模板质量较高,可以满足cDNA-AFLP对于cDNA的要求。约300ngcDNA分别经限制性内切酶EcoRⅠ,37℃,2h以及MseⅠ,65℃,5h完全酶切,MBIT4连接酶5U,22℃,连接过夜;连接产物最佳稀释倍数为2倍,预扩增产物稀释倍数为20倍;20μL扩增体系中,Mg2+浓度1.5mmol/L,dNTP浓度0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶加1U。PCR产物经6%PAGE电泳得到清晰、稳定的多态性条带。本研究建立的cDNA-AFLP反应体系,为杉木木材形成相关功能基因的克隆和分子生物学研究提供了有用的数据。