目的:构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒,研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)活化、增殖、凋亡、分泌细胞外基质(ECM)的影响方法:以NOV为目的基因,以质粒psiRNA- hHlneo为载体,构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA (psiRNA1,2,3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA.限制性酶切和测序鉴定构建成功后,脂质体介导重组质粒转染HSC,依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组,并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组.半定量RT-PCR检测HSC的NOV、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达情况,Western blot检测α-SMA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOVsiRNA表达质粒:与阴性对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV、α-SMA的mRNA表达水平下降(73.0% vs 23.2%,51.4% vs 15.1%,均P<0.05),Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显下降(59.8% vs 17.0%,37.1% vs 6.6%,P<0.05),α-SMA蛋白表达水平下降.与空白对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内HSC增殖活性显著降低(24 h:0.172±0.005 vs 0.318±0.018.P<0.05:48 h:0.296±0.004 vs 0.472±0.029,P<0.05:72 h:0.432±0.024 vs 0.672±0.050,P<0.05).psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV mRNA、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达及HSC增殖活性均无明显下降(均P>0.05).结论:NOV可促进HSC增殖、活化及分泌细胞外基质,提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点.
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