绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化

摘要

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法Adeno-X^TM-GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔MSCs共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement,CPC）-纤维蛋白胶（fibrin glue,FG）复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯CPC-FG复合支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和型胶原、骨钙素（osteocalcin,OC）免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,Masson染色观察新骨形成。结果Adeno-X^TM-GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3×108pfu/ml。Adeno-X^TM-GFP感染MSCs后96h,可见GFP表达,感染率达50%～70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、2、3周,实验组ALP活性分别为12.546±1.091、16.567±0.659和20.443±0.706,对照组分别为0.453±0.113、0.243±0.018和0.308±0.056,差异有统计学意义（P〈0.05）。4周,实验组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC-FG复合支架材料部分降解;实验组型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。结论组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。