体外转录法制备登革热1-4型病毒RNA片段

摘要

目的通过体外转录获得登革热1-4型病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计登革热1-4型病毒基因保守区克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含登革热1-4型病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6 ng/μl、384.2 ng/μl、457.3 ng/μl、368.7 ng/μl,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为登革热1-4型病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。