含发夹结构的Gateway质粒DNA测序方法改进

摘要

Gateway克隆技术现已广泛用于cDNA文库构建。然而,用常规DNA测序程序对Gateway cDNA进行测序时,反向重复的att序列易形成发夹结构,导致测序质量较差,且测得的序列较短,成为Gateway克隆技术应用的限制因素。本研究报道了1种Gateway cDNA克隆高温变性测序方法,即在Gateway cDNA测序PCR反应之前,先将DNA在98℃预变性5 min,可有效防止测序峰值的快速下降,极显著地增加Gateway cDNA克隆测序长度(质量Q≥20的序列平均长度从528 bp提高到816 bp)。该方法在常规DNA测序程序的基础上仅新增了5 min的高温预变性,不增加任何实验成本和操作步骤,非常适合Gateway质粒DNA的大规模测序。