重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

摘要

目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA,构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白(rTCS)后,分析rTCS和nTCS(天然天花粉蛋白)对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCScDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+)并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白,MTT法分别检测rTCS和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1.成功克隆获得TCS的cDNA并构建pET-28a(+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内(0～8h);rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4.MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对He-La宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义(P(0.05);rTCS的IC50小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a(+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。