Villin1启动子调控miR-7-Sponge真核表达载体的构建及其对小鼠炎症性肠炎模型的影响

摘要

目的构建绒毛蛋白(Villin1)启动子调控的miR-7海绵体序列(简称miR-7 Sponge)的真核表达载体,观察其对小鼠炎症性肠病(IBD)模型病理损伤的影响。方法荧光原位杂交(FISH)检测葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium salt,DSS)作用后小鼠结肠组织中miR-7的水平及定位情况;抽提小鼠结肠组织基因组DNA,PCR扩增Villin1启动子序列,纯化该产物并经Kpn I/Mlu I双酶切,克隆入pGL3-Basic载体,构建pGL3-Basic-Villin1启动子真核表达载体(p-V);随后将p-V和miR-7-Sponge(化学合成)分别经Mlu I/Xho I双酶切、连接,构建pGL3-Villin1-miR-7-Sponge真核表达载体(命名为p-V-miR-7sp),通过酶切和测序鉴定载体。通过2%DSS喂养野生型(WT)小鼠7 d,3 d水恢复,建立IBD小鼠模型,分别在建模的第2,4,6天通过尾部静脉注射p-V和p-V-miR-7sp载体进行治疗;Real-time PCR检测心、肝、肾、淋巴结及结肠组织中miR-7的表达,观察小鼠结肠形态和长度的变化,H&E染色分析小鼠结肠组织病理结构及炎症损伤变化。结果(1)酶切和测序结果显示成功构建p-V-miR-7sp真核表达载体;(2)Villin1启动子调控的miR-7-Sponge真核表达载体可特异降低结肠组织中miR-7的表达水平(P<0.05);(3)与对照组比,p-V-miR-7sp治疗组IBD模型小鼠结肠长度明显增加;H&E染色显示结肠组织中淋巴细胞浸润明显减少,隐窝结构轻微破坏,其损伤明显减轻。结论Villin1启动子调控的miR-7-Sponge真核表达载体不仅特异降低结肠组织中miR-7水平且明显减轻IBD模型小鼠的病理损伤。