前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体的构建及鉴定

摘要

目的克隆前纳豆激酶原基因,实现其在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究。方法从枯草芽孢杆菌中分离纯化基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α;将目的基因片段与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒pENK,转化大肠杆菌BL21(DE3),对其表达条件进行研究。结果序列检测结果表明,所克隆片段全长1152bp,与Genbank中已报道序列相比较,同源性达到100%。转化菌pENK108-BL21(DE3)经IPTG诱导表达目的产物,SDS-PAGE检测结果显示具特异条带,Western Blotting检测结果表明,表达产物确系目的融合蛋白。转化菌pENK108-BL21(DE3)在LB培养基中经37℃培养,1mmol/L IPTG诱导4h后,目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的31%。时间凝块法显示表达物具有一定的纤溶作用。结论成功构建前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体,并对转化菌的表达条件进行了研究。