5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR方法的建立

摘要

目的建立扎伊尔型（EBOZ）、苏丹型（EBOS）、科特迪瓦型（EBOC）、本迪布焦型（EBOB）和莱斯顿型（EBOR）埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法,一次检测可实现5种埃博拉病毒的分型。方法比较5种15株埃博拉病毒基因组的保守性和特异性,设计5种埃博拉病毒特异性引物和探针用于核酸检测,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR分别使用FAM、VIC、Texas red、FAM、VIC荧光基团标记探针。分2管对5种埃博拉病毒进行多重实时荧光PCR检测,其中管1检测EBOZ、EBOS和EBOC,管2检测EBOB和EBOR。使用不同浓度的埃博拉病毒阳性对照质粒进行检测,确定最佳的引物、探针用量和Mg2+用量,建立5种埃博拉病毒分型检测的多重实时荧光PCR方法。同时,对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析。结果优化的多重实时荧光PCR方法的引物和探针终浓度分别为160 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L。建立的方法灵敏度为103拷贝/ml,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR实时荧光PCR检测10次的CV值分别为0.16%、0.25%、0.24%、0.22%、0.28%。埃博拉病毒多重实时荧光PCR对马尔堡病毒阳性对照,登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒等阳性毒株检测结果为阴性。结论建立的5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别。