FIP-fve基因沉默载体构建和金针菇的遗传转化

摘要

为了探究金针菇FIP-fve基因对金针菇本身的生物学功能,本研究克隆FIP-fve基因正反片段并构建其RNAi载体,并将其转化农杆菌LBA4404,建立以农杆菌介导的金针菇遗传转化体系。双酶切琼脂糖电泳检测结果表明成功构建了FIP-fve基因的RNAi载体:p TCK303-fve(F)-fve(R),并用液氮转化法获得重组农杆菌转化子。金针菇遗传转化以菌丝体为外植体,潮霉素B(Hygromycin B)和头孢霉素(Cephalosporins)使用浓度分别为9μg/m L和600μg/m L。重组农杆菌浓度OD600为0.5,侵染金针菇菌丝体30 min,共培养培养基AS使用浓度为200μg/m L,共培养25℃3 d,抗性筛选10 d。最终通过潮霉素抗性筛选和PCR检测从60个外植体中筛选得到5个金针菇遗传转化子,转化率为8.33%。经过连续培养,对比观测转化子和野生型金针菇,FIP-fve基因沉默的金针菇转化子菌丝的生长在第3天、第6天和第10天明显慢于野生型金针菇菌丝。初步说明FIP-fve基因对金针菇菌丝体时期的生长发育具有一定调节作用,这为研究金针菇FIP-fve以及FIP对真菌本身生物学功能提供一定研究基础和直接证据。