HBV阿德福韦酯耐药位点基因突变检测方法的建立

摘要

目的探究并评价Taqman锁核酸(Locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)在检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染患者阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药位点基因突变中的应用价值。方法通过基因测序筛选阳性样本,进而构建ADV重组质粒标准品、标准曲线等,以构建的重组质粒为标准品建立实时荧光定量PCR反应体系,评价其线性范围、扩增效率、灵敏度及重复性等指标。结果rtA181V、rtN236T位点野生型和突变型重组质粒被成功构建;Taqman-LNA荧光PCR检测的线性范围为1×10^9/μl^1×10^2/μl;rtA181V、rtN236T位点野生型及突变型质粒标准品的扩增效率均高于75;rtA181V位点可稳定准确检测到最低为0.04%的突变比例,rtN236T位点可稳定准确检测出最低为0.05%的突变比例,则Taqman-LNA荧光PCR检测rtA181V和rtN236T位点临床标本的灵敏度分别为0.04%和0.05%;rtA181V、rtN236T位点野生型及突变型质粒标准品在高、中浓度中的变异系数均<5%。结论Taqman-LNA荧光PCR检测法线性范围广、扩增效率高、灵敏度高、重复性好,是一种快速、简便、灵敏的基因突变检测方法,在检测HBV感染患者ADV耐药位点基因突变中具有较高的应用价值和临床意义。