利福平耐药基因突变位点的分析及M-ARMS-PCR检测方法的建立

摘要

背景研究:
　　结核性脑膜炎由结核杆菌引起的中枢神经系统感染是最严重的肺外结核。虽然结核菌的耐药率在结核性脑膜炎患者中明显低于肺部感染患者,但是多耐药结核性脑膜炎的患者会遗留更严重的神经系统后遗症或者直接死亡,给社会和家庭造成了严重的负担。患者常会缺乏快速准确的诊断和药物敏感性检测,而延误治疗,最终导致严重后遗症、产生多耐药结核或使多耐药结核杆菌更进一步发展成为广泛性耐药,使得结核控制产生了更严峻的挑战。WHO推荐结核杆菌感染患者需要早期接受正规,足量治疗,并且每个患者需接受药物敏感性检测性,并根据其耐药诊断,选择合理的药物治疗。规范的治疗在肺结核治疗中降低致残率和致死率并且提高预后和控制多耐药结核的发生率等方面都起到了明显的作用。但是目前结核性脑膜炎治疗中,由于没有明确的诊断和治疗指南,往往是根据肺结核的诊治方法及经验用药。且由于血脑屏障等因素,往往用药剂量和时程均大于肺结核,例如在结核性脑膜炎的经验治疗中利福平用药比肺结核治疗时,剂量大,时间长,没有规范治疗和用药则更有可能导致利福平耐药。但是由于结核性脑膜炎病例很难收集,脑脊液结核杆菌数量少,很难培养成功等现状,针对结核性脑膜炎患者的耐利福平结核分枝杆菌基因突变等机制研究及结核性脑膜炎耐药检测方法研究并不充分,更无法做到询证医学。所以多耐药结核性脑膜炎检测及机制还有需要更多的研究支持。
　　目的:
　　鉴于肺结核与结核性脑膜炎治疗中利福平用药剂量及治疗时间上的差异,探究这两种患者中的利福平耐药的突变位点是否存在差异;建立一个快速,简单,高通量,低成本的检测方法可以检测结核分枝杆菌耐药突变基因,并用于结核性脑膜炎的诊断。
　　方法:
　　通过测序的方法比较导致结核性脑膜炎的结核分枝杆菌利福平耐药基因突变机制与致肺结核结核分支杆菌耐药基因突变位点有无差别,并根据结核耐药数据库给予的结果,选取高度确信耐药位点,通过NCBI的GENE数据库获得rpoB基因(Rv0667),根据M-ARMS-PCR原理进行设计引物,设计五对引物分别为1037OF-1048OR;511IF-1478OR;516IF-1478OR;526IF-1478OR;531IF-1478OR,其中5个单独的上游引物,均与下游1478OR组成4对引物,分别形成半巢式PCR,产物大小分别:442bp、227bp、214bp、183bp、166bp。选取135例培养阳性并通过药敏检测的结核分支杆菌菌株,进行M-ARMS-PCR扩增,并应用QIAxcel仪器进行检测分析。同时针对这135例菌株的耐药决定区域进行DNA测序。应用药敏结果和测序结果对M-ARMS-PCR方法进行评价。
　　结果:
　　本次研究通过测序的方法对比导致结核性脑膜炎利福平耐药的结核分枝杆菌与导致肺结核结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变的分布情况,102株利福平耐药的结核分枝杆菌的rpoB基因测序发现,63株导致肺结核的结核分枝杆菌的rpoB基因突变常见位点为:531(53.97％),526(20.63%),516(6.45%)。39株导致结核性脑脑膜炎的rpoB基因突变最常见位点为:531(61.54%),526(20.51%),533(7.69%)。建立了基于QIAxcel检测平台的利福平耐药基因rpoB检测的M-ARMS-PCR检测方法。这种方法能够单管5重选择性PCR扩增rpoB基因高度确信耐药四个密码子511、516、526、531的野生型基因,不扩增突变型。M-ARMS-PCR结果中,131例样品与DNA测序结果一致。用DNA测序方法评价M-ARMS-PCR方法的敏感度为94.2%,特异性为100%。药敏检测方法评价M-ARMS-PCR的方法的敏感度为86.57%,特异性为89.71%。
　　结论:
　　通过本次试验了解了导致结核性脑膜炎的结核分支杆菌利福平耐药rpoB基因最常见的突变区域为531-533区域。其中531位密码子的Ser-Leu突变率占明显优势。
　　建立的基于QIAxcel检测平台的M-ARMS-PCR的检测方法检测利福平耐药基因突变,可以在6个小时能完成96个样品检测达到了预期实验目的。具有便捷,快速,准确,早期,廉价的优点,适宜应用于贫困,医疗水平相对落后的地区。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

前言

文献回顾

正文

实验一 结核性脑膜炎与肺结核病例中结核分枝杆菌耐利福平相关基因突变分布分析

引 言

1 实验材料及仪器

3 结果

4 讨论

实验二 基于QIAxcel平台的多重扩增受阻突变体系检测利福平耐药基因方法的建立

引 言

1 实验仪器和材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢