死亡相关蛋白激酶3缺乏与抑制内质网应激减轻血管钙化的机制研究

摘要

目的探究死亡相关蛋白激酶3（death-associated protein kinases 3,DAPK3）缺乏是否通过抑制内质网应激而减轻血管钙化。方法采用前瞻性队列研究方法,通过体外细胞培养实验进行观察分析。人主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）采用F10K Kaighn′s改良培养基培养,根据培养基中是否添加β磷酸甘油（10 mmol/L）分为钙化组和非钙化组。钙化组细胞和非钙化组细胞又分别分为DAPK3抑制组及其对照组、内质网应激抑制组及其对照组、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）激活组及其对照组、DAPK3抑制+腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein Kinase,AMPK）抑制以及空白对照组。测定各组的VSMC中DAPK3 mRNA以及蛋白浓度、钙含量、碱性磷酸酶、VSMC分化标志基因（SM22α、α-SMA）蛋白浓度、成骨分化转录因子[Runχ2、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）]蛋白表达浓度、内质网应激标志蛋白（AFT4、GRP78、GRP94以及CHOP）表达水平以及p-PAMK蛋白表达。结果钙化细胞DAPK3 mRNA（第14天达最高值15.24±0.72）以及蛋白（第14天达最高值11.31±0.38）显著高于非钙化细胞（5.63±0.62、2.59±0.33）,差异有统计学意义（P＆0.001）。钙化细胞中,DAPK3缺乏组钙含量（86.54±8.21） mmol/g较对照组（194.63±8.54） mmol/g显著降低（t=22.35,P＆0.001）、碱性磷酸酶活性显著降低[（96.27±10.28） IU/g蛋白与（224.67±10.94） mmol/g蛋白,t=20.951,P＆0.001]、VSMC分化标志基因（SM22α、α-SMA）蛋白的表达显著上升[SM22α:（0.82±0.14）与（0.44±0.13）,t=4.872,P=0.001;α-SMA:（0.95±0.18）与（0.56±0.13）,t=4.303,P=0.002]、而骨分化转录因子（Runχ2、BMP2）蛋白表达显著降低[Runχ2:（1.12±0.28）与（2.21±0.35）,t=5.957,P＆0.001;BMP2:（0.82±0.12）与（1.26±0.16）,t=5.39,P＆0.001]、MAPK水平上调（DAPK3抑制组钙化细胞0.74±0.12、非钙化细胞1.04±0.14高于对照组钙化细胞0.44±0.10、非钙化细胞0.78±0.12,t=4.704,P=0.001;t=3.454,P=0.006）;抑制ESR钙化细胞的钙含量显著降低（细胞经AMPK通路抑制后转染shRNA组150.21±11.98、细胞转染shRNA组83.21±12.12低于转染空白对照组164.82±12.34,P＆0.001）;碱性磷酸酶活性显著降低（细胞经MAPK通路抑制后转染shRNA组226.54±16.57、细胞转染shRNA组112.34±15.96低于转染空白对照组242.32±16.32,P＆0.001）;激活MAPK钙化细胞的钙含量显著降低（P＆0.001）、碱性磷酸酶活性显著降低（P＆0.001）。结论 DAPK3缺乏通过AMPK信号通路抑制内质网应激达到减缓VSMC钙化的作用。