体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

摘要

目的 通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线.用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72 h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10 μmol/L,最佳作用时间24 h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达.结果 倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核.传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性.流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为旱阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性.细胞生长曲线显示前3 d处于细胞潜伏状态.第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰.细胞蒯期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%.10μmol/L5-Aza诱导后7 d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达.14 d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达.21 d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达.28 dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达.结论 成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择.