蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素

摘要

目的探讨蛋白免疫印迹半定量分析的影响因素,为在蛋白水平上研究药物的药理作用提供指导。方法提取丙型肝炎病毒(HCV)感染的Huh7.5细胞内总蛋白,蛋白定量后,以丙型肝炎病毒编码的核心蛋白为目的蛋白,以管家基因编码的蛋白Tubulin或Gapdh为内参对照,分析蛋白上样量、抗体浓度及孵育时间、发光液浓度等可变因素对蛋白免疫印迹半定量分析结果的影响。结果蛋白免疫印迹半定量结果中目的蛋白相对强度与蛋白总上样量之间只在一定上样量范围内有线性关系,超出线性范围会导致相对蛋白强度变化幅度减少,甚至无变化;上样体积、内参的选择不影响实验结果;在条带质量较好的前提下,一抗浓度及其孵育时间和发光液浓度也不改变实验结果;但是半定量有一定的缺陷,实验结果有一定的误差,应在15%以内。结论影响蛋白免疫印迹半定量结果的主要因素为目的蛋白的上样量;在能获得条带质量较好的前提下,改变上样体积和抗体孵育时间、适当稀释抗体和发光液浓度有利于实验进展而不影响实验结果。