分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

摘要

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗（BCG）菌株。方法采用多聚合酶链反应（PCR）方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60（Hsp60）基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌（E.coli.）BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体,分别命名为pDE22Ag85B ESAT6和pDE22ESAT6Ag85B,将纯化的重组质粒电穿入BCG,经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液,经浓缩和透析后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）和固相化蛋白质免疫学测定（Western blot法）分析。结果两株重组BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白,且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。