碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究

摘要

广泛采用提取DNA作为PCR模板的方法主要有CTAB和SDS法2种,但步骤烦琐、耗时长.根据Taq酶储存液和PCR反应缓冲液所含K+离子、Cl-离子和Tween-20等成分,以0.05 mol/L KOH为强碱裂解物、2%Tween-20为稳定剂配制碱裂解液,以0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)和2 mmol/L EDTA为中和液,经加热裂解和中和两步制备PCR模板.以甘蔗叶片为材料,用新鲜配制含KOH和Tween-20的裂解液,将适量叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解,再中和,形成裂解混合物.直接以裂解混合物为模板,甘蔗内源基因为靶基因,在优化KOH裂解浓度、模板体积、加热裂解时间以及添加适量聚合酶稳定剂的情况下,PCR反应稳定,重复性强.以有代表性的单子叶和双子叶植物叶片为材料,经过多种内源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法的广泛适用性.该方法通过两步制备PCR模板,无需DNA提取过程,使用材料少,可以实现活体PCR检测,为遗传分析和分子诊断提供简便、快速和高效的分析方法.